Cryo Micro Station 3.1

Tieftemperaturmesszelle, Fluoreszenzmikroskop-Erweiterungsmodul

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Abb. 1: Konzeptskizze CMS

Funktionalität

Die Cryo Micro Station (CMS) 3.1. stellt dem Fluoreszenzmikroskopiker eine spezielle Messzelle zur Verfügung, bei der zu analysierende Proben im Vakuum auf bis 20K abgekühlt werden können, so dass die Fluoreszenzausbeute der „molecules of interest“ gesteigert wird. Die Messzelle kann ein Chamberslide mit bis zu 8 Proben aufnehmen. Über ein Quarzglasfenster (Durchmesser 10 mm / Dicke 0,8 mm) können die gekühlten Proben reproduzierbar untersucht werden. Der innerhalb der gekühlten Messzelle montierte x-y-Trieb ermöglicht ein Abrastern der Proben im Bereich 50 x 25 mm (Arbeitsbereich Standardobjekträger) und ist über Joystick oder Eingabe bedienbar.

Die interne Speicherfunktion der µm-Triebe erlaubt eine Merkfunktion für 10 verschiedene Messpunkte, welche bei Bedarf für weitere Messungen angefahren werden können. Um konfokale Aufnahmen zu gewährleisten, wird die Messzelle in vertikaler Richtung dem z-Hub des Mikroskoptisches nachgeführt.

Die CMS 3.1 wurde so konstruiert, dass sie an gängige Standardmikroskope von Leica, Zeiss etc angekoppelt werden kann.

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Abb. 2: Prinzipschema CMS

Die zu untersuchende Probe wird auf einem bis zu 8 Kammer-Chamberslide (CS) (25 mm x 76 mm) aufgetragen und dieses in die Messzelle (MZ) gelegt und mit einem Deckel verschlossen, der eine kreisrunde Öffnung mit einem Quarzglasfenster besitzt. Nachdem die Probe in der Messzelle positioniert ist, wird die CMS 3.1 achsmittig zum Glasfenster im Messzellendeckel per Rollmechanismus unter den Strahlengang des Mikroskop geschoben. Die Vakuumkammer (VK) wird mittels Vakuumpumpstand auf Isolationsvakuum (Hochvakuum) evakuiert. Ein geschlossener Heliumkreislauf, bestehend aus Kompressor, Flexlines und Kaltkopf, erzeugt Kälte, die über einen Kältefinger (KF) bis in Messzelle zum Probenträger transportiert wird. Innerhalb von 100 min wird dabei eine Temperatur von 25K an der Probe erreicht. Ein Positioniersystem lässt alle Positionen (x-/y-Richtung) auf dem Chamberslide im eingekühlten Zustand abfahren. Dabei kann die gewünschte Position über die Bedienoberfläche am Steuerrechner eingegeben werden, oder per Joystick angefahren werden. Die Fokussierung der Probe in z-Richtung erfolgt über die Mikroskoptisch (MT) des Mikroskops. Ein Abstandssensor regelt die Messzelle dem Mikrokoptisch nach.

Anwendungen in der markerfreien Analytik

Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zum Nachweis von Molekülen in Zellen oder Gewebe sind eine weit verbreitete Anwendung. Dazu werden in der Regel die zu untersuchenden Zellbestandteile oder Moleküle mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Dies erfordert Manipulationen an den Zellen, wie Fixierung und Permeabilisierung oder Mikroinjektion, bzw. Veränderungen an den Molekülen wie direkte Kopplung von Farbstoffen oder die Expression fluoreszierender Fusionsproteine. Diese Veränderung der Probe kann jedoch nicht bei allen wissenschaftlichen Fragestellungen akzeptiert werden und so ist in den letzten Jahren ein starker Trend hin zur markerfreien Analytik zu beobachten.

Die NanoscopiX Cryo Micro Station (CMS) ermöglicht eine Analytik, welche markerfrei oder mit deutlich verminderten Einsatz von Markern durchgeführt werden kann. Durch einfaches Herabkühlen der mikroskopischen Probe werden verschiedene Fluoreszenzlöscheffekte vermindert und somit die Ausprägung von spezifischen Eigenfluoreszenzen der Moleküle unterstützt.

Auf diese Weise kann zum Beispiel der Weg eines Stoffes innerhalb der Zelle verfolgt werden (z.B. eines Medikamentes zum Wirkort). In der Regel müssen diese Moleküle in geeigneter Weise markiert werden. Eine solche Markierung verändert jedoch zugleich viele wichtige chemische und physikalische Parameter des Stoffes bzw. der Zelle. Dadurch wird die natürliche Umgebung des Moleküls und/oder dessen ursprünglicher Weg beeinflusst (z.B. markiertes Medikament nicht zellpermeabel). Die Wahl der geeigneten Markierung ist somit zeitaufwändig, unter Umständen sogar erfolglos. Durch den Einsatz der CMS konnten wir ein Zielmolekül über seine spezifische Eigenfluoreszenz analysieren, wodurch die Notwendigkeit einer Markierung überflüssig wurde. (Tondera et al., 2013). //Tondera, C., Laube, M., Wimmer, C., Kniess, T., Mosch, B., Großmann, K., Pietzsch, J. (2013) Visualization of cyclooxygenase-2 using a 2,3-diarylsubstituted indole-based inhibitor and confocal laser induced cryofluorescence microscopy at 20 K in melanoma cells in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications 430, 301–306//

Generelle Vorteile für Anwendungen in der Zellbiologie

Verstärkung der spezifischen Fluoreszenz

Unzureichende Stärke des Fluoreszenzsignals ist eines der häufigsten Probleme in der Fluoreszenzmikroskopie.

Durch den Einsatz der CMS kann die spezifische Fluoreszenz des Zielmoleküls unterstützt werden, wodurch geringere Konzentrationen an Marker nachgewiesen werden können (siehe Abb. 3)

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Abb. 3: Murine Melanomazellen (B16 F10) angefärbt mit 5-hexadecanoylamino-fluorescein (Membranmarker λexc 488 nm) und DAPI (DNA-Marker λexc 351 nm) bei einer Probentemperatur von 20°C (RT) und 22 K unter Zugabe verschiedener Konzentrationen der Markerfarbstoffe: oben) 1,5 µM 5-hexadecanoylamino-fluorescein / 30 nM Dapi und unten) 150 nM 5-hexadecanoylamino-fluorescein – 3 nM Dapi. Die Einstellungen am Mikroskop wurden bis auf die Temperaturbedingungen und den Digitalzoomfaktor konstant gehalten.

 

Verminderung von Photobleaching

Bei andauernder Lichteinstrahlung bleichen bei Raumtemperatur die meisten Farbstoffe stark aus. Das führt häufig dazu, dass das von der Probe gesendete Fluoreszenzlicht nicht ausreicht, um die gesamte Probe dreidimensional darstellen zu können. Durch den Einsatz der CMS wird das untersuchte Molekül gegenüber der Ausbleichung durch Licht stabilisiert, was, molekülspezifisch zu einer deutlichen Verlängerung der Messzeit führt (siehe Abb. 4).

Bild 2: Murine Melanomazellen (B16 F10)angefärbt mit 5-hexadecanoylamino-fluorescein (Membranmarker λexc 488 nm) bei einer Probentemperatur von 20°C (RT) und 22 K. Das Laserlicht der Wellenlänge 488 nm wurde über die Dauer von 24 min auf die Probe fokussiert und die Ausbleichung der Probe abgebildet. Die Einstellungen am Mikroskop wurden bis auf die Temperaturbedingungen und den Digitalzoomfaktor konstant gehalten.

Abb. 4: Murine Melanomazellen (B16 F10)angefärbt mit 5-hexadecanoylamino-fluorescein (Membranmarker λexc 488 nm) bei einer Probentemperatur von 20°C (RT) und 22 K. Das Laserlicht der Wellenlänge 488 nm wurde über die Dauer von 24 min auf die Probe fokussiert und die Ausbleichung der Probe abgebildet. Die Einstellungen am Mikroskop wurden bis auf die Temperaturbedingungen und den Digitalzoomfaktor konstant gehalten.

 

Messungen mit Anregung im UV-Bereich

Messungen mit Anregung im starken UV-Bereich können bei Raumtemperatur, aufgrund der mangelnden Stabilität vor allem von biologischen Proben gegenüber hochenergetischem Licht nur begrenzt durchgeführt werden. Dabei sind viele interessante und relevante Biomarker gerade im UV-Bereich in ihrer optimalen Anregung. Durch den Einsatz der CMS wird das untersuchte Molekül gegenüber der energiereicheren UV-Strahlung stabilisiert, was, molekülspezifisch zu einer deutlichen Verlängerung der Messzeit führt.

Weitere Anwendungsgebiete

  • Materialforschung – Untersuchungen zum Temperaturverhalten von Werkstoffen (Legierungen / Einschlüssen etc.)
  • Elektrotechnik – temperaturabhängiges Verhalten supraleitender Werkstoffe
  • Materialforschung /Elektronik – organische Elektronik Auflösung von Nanostrukturen bei niedrigen Temperaturen
  • Beschichtungstechnik – OLED- Beschichtungen Temperaturverhalten
  • Umweltchemie/ Umweltanalytik – Ausbreitungsverhalten umweltanalytisch relevanter Schwermetalle (Actiniden – Lanthaniden) in der Natur

Technische Spezifikation

Adaption an kommerzielle Mikroskope Ankopplung in wenigen Sekunden über ein Sliding – System:
Die Messzelle ist während der Abkühl und Aufheizzeit einfach vom Mikroskoptisch an- bzw. abdockbar.
Objektive bis 63-fache Vergrößerung:
maximale numerische Apertur der Objektive: NA = 0,95 (Luftobjektiv)
Probenpositionierung horizontal (x, y) in der Messzelle (Schrittmotoren)

  • Ansteuerung per direkter und indirekter Eingabe
  • Schrittweite 0,2 µm bis 3 mm
  • Max. Verfahrgeschwindigkeit 3 mm/s
  • Maximaler Verfahrweg 50 x 25 mm
  • Speichermöglichkeit und Recovery für bis zu 10 Messpunkte
Probenpositionierung vertikal (z-Achse) Die komplette Messzelle wird dem Mikroskoptisch nachgeführt

  • Ansteuerung: per direkter und indirekter Eingabe
  • Schrittweite in Abhängigkeit von eingestellter Schrittweite des Mikroskoptisches
  • Maximaler Verfahrweg +/- 10 mm
  • Speichermöglichkeit und Recovery für bis zu 5 Messpunkte
Temperaturführung
  • Bereich: 300 K – 20 K
  • Temperaturschritte: 1 K
Drucksteuerung Vorvakuum 10-3 bar / Hochvakuum 10-7 bar
Einkühldauer 1,5 h
Aufheizdauer 0,5 h
Automatisierung SPS gestützte Automatisierung aller Parameter über ein einheitliches Programm (PC)
Schwingungsdämpfung Passivsystem